近日，我校生物學院高宏波教授課題組在最新一期的植物學高水平國際期刊《Plant Communications》（一區，IF="10.5）發表了題為“A new method based on the release of fluorescent protein tag by TEV protease for studying the orientation of membrane proteins in plants”的研究論文，開發出了一種研究植物膜蛋白在細胞中的定位取向的新方法。
真核生物的細胞具有復雜的膜系統和多種膜性細胞器，在這些膜上含有許多具有重要功能的蛋白質，它們多數都含有一個或多個跨膜結構域。膜蛋白在膜上定位的方向是決定其功能的一個關鍵因素，影響著其工作機制、與其他蛋白的相互作用以及功能的實現。
經典的研究膜蛋白定位取向的方法是分離細胞器或細胞組分然后進行蛋白酶切等生化分析，但是該方法操作起來并不容易。熒光蛋白酶保護(FPP)實驗是一種新興且被廣泛使用的研究膜蛋白取向的方法。然而，該方法基于動物細胞，在植物膜蛋白的分析研究中效果不好。
高宏波教授課題組利用煙草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶定點切割并釋放熒光蛋白標簽(RFT)，開發出了一種更簡單有效的分析植物細胞中膜蛋白取向的方法。該方法通過構建融合蛋白載體，將黃色熒光蛋白（YFP）添加到感興趣的膜蛋白的N端或C端，并在膜蛋白和YFP之間加入TEV蛋白酶識別和切割序列ENLYFQS。在植物細胞中共表達融合蛋白和TEV蛋白酶，當融合蛋白暴露于胞質中的TEV蛋白酶時，YFP要么被膜保護，要么從膜上釋放，這取決于每個膜蛋白的定位取向和末端的位置（圖1）。
圖1.利用RFT方法分析膜蛋白定位取向的原理示意圖
通過熒光顯微鏡觀察熒光蛋白定位的變化或不同，可以很容易地推斷出融合蛋白在膜上的定位取向（圖2）。結合Western blot分析，該方法可以進一步驗證上述顯微觀察結果。
圖2.內質網膜蛋白CNX1的定位取向分析
RFT方法理論上也可以應用于動物細胞。此外，RFT方法可以經過一些修改并應用到更廣泛的研究中去，例如，改變蛋白質的亞細胞定位，激活或破壞一個蛋白質。
高宏波教授為該研究論文的通訊作者，博士研究生胡靜蕾和常寧為共同第一作者。該研究得到了中央高校基本科研業務費專項資金和國家自然科學基金的資助。
論文鏈接：https://www.cell.com/plant-communications/fulltext/S2590-3462(23)00113-X#
